反转录—定量 RT-PCR 的第一步
RT-qPCR 最常见应用之一是测定 mRNA 水平随时间、空间或特殊处理后 (如药物处理) 的变化。由于 RT-qPCR 的灵敏度高于 RT-PCR ， RT-qPCR 也广泛用于检测是否存在逆转录病毒 (RNA 病毒)。与 RT-PCR 实验流程类似， RNA 首先转化为 cDNA ，然后通过 PCR 扩增。主要的区别在于，在指数扩增阶段，RT-qPCR 是通过荧光实时检测 cDNA 扩增的水平。此扩增水平作为对 RNA 中初始靶标进行定量的基准。
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视频：反转录酶对 Ct 值的影响
了解 qPCR 中 Ct 值的含义，哪些因素会影响 Ct 值以及如何选择反转录酶以改善 Ct 值。
视频：克服 RT-qPCR 中的挑战
了解使用 RT-qPCR 进行基因表达分析中出现变异的五大原因，以及克服常见 RT 失误和挑战的技巧。
通过 RT-qPCR 进行基因表达定量检测的准确性在很大程度上取决于 cDNA 模板的质量和数量。因此，反转录步骤对于 RT-qPCR 的成功至关重要。反转录步骤应产生能代表初始 RNA 的 cDNA 产物。因此，所选择的反转录酶应该具有高效合成 cDNA 的能力，即使对于低丰度基因和纯度不佳或复杂 RNA 样本 (如高 GC 含量、含抑制剂、降解样本) 。
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除了高效的反转录酶外，选择用于 RT 反应的试剂时还有许多考虑因素。首先，在较宽的起始量 RNA 范围内，cDNA 的动态范围或线性扩增至关重要。获取与起始 RNA 量成比例 cDNA 产量的能力可确保对基因表达的准确定量分析（图2）。
白皮书： 改进型反转录酶
图2.在一系列不同起始量总 RNA，使用 RT 预混液扩增后 qPCR 结果的线性度，用于检测 (A) 高丰度和 (B) 低丰度 RNA 靶标。RNA 起始量从 10 μg 到 1 μg ，经反转录，随后通过 PCR 扩增。两种预混液均生成与 RNA 上样 量成比例的 cDNA，但如较低 (即早期) CT 值所示，从预混液 1 中获得更高的产量，尤其是对于低丰度基因靶标。
此外，所选的试剂应能在重复实验中获得大量且一致的 cDNA 得率，以获得灵敏度高且差异性小的基因表达结果 (图 3)。含有反转录所需所有成分的单管预混液有助于尽可能减少实验变量、交叉污染和移液失误。
白皮书： 经优化的 RT-qPCR 预混液
图3.使用不同 RT 预混液后 qPCR 结果的灵敏度和变异性，用于检测 (A) 高丰度和 (B) 低丰度 RNA 靶标。在这些试剂中， 30 次重复实验后，预混液 1 的平均 值和标准偏差最低，说明反转录试剂的选择对进行可靠基因表达分析的重要性。
一种特殊的 RT-qPCR 是直接从粗细胞裂解物中进行反转录，而无需分离 RNA [1]。在研究少量细胞的实验中，使用稀缺的样或选择特定细胞时，可考虑进行直接 RT-qPCR 以防止潜在样本损失和低 RNA 回收率。在直接 RT-qPCR 中，抑制内源性 RNase（其可降解 RNA）和在细胞裂解过程中去除细胞基因组 DNA 非常重要。使用针对低丰度靶标而优化的试剂盒，样品制备可以在短短 7 分钟内完成，同时可从。 具有高持续合成能力的反 转录酶尤其适用于对未纯化 RNA 提取物的反转录，因为其具有对抑制剂较高的耐受性和高灵敏度。